不同內毒素破壞方法的比較研究

一、介紹

干熱法是制藥行業(yè)公-認的去熱原方法。本文介紹了一系列研究，以確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。去熱原是指去除或滅活熱原。在實(shí)踐中，通過(guò)證明去熱原工藝能夠將細菌內毒素降低到可接受的水平來(lái)對其進(jìn)行鑒定。與滅菌一樣，去熱原是一個(gè)絕對的術(shù)語(yǔ)，由于測試不敏感，只能在理論上進(jìn)行證明[1]。

玻璃器皿的去熱原在腸胃外藥物的生產(chǎn)中非常重要，因為殘留的熱原最終可能被注射到患者體內，導致不良反應。在實(shí)驗室中，用于細菌內毒素檢測的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，以最-大-程-度地減少檢測污染；采樣容器也必須不含熱原，以避免樣品污染和檢測到假陽(yáng)性結果[2]。對注射用藥物生產(chǎn)中使用的玻璃器皿構成風(fēng)險的主要熱原物質(zhì)是內毒素。內毒素是革蘭氏陰性菌外壁中含有的天然熱穩定脂多糖[3]。它在細菌細胞死亡、裂解、生長(cháng)和增殖過(guò)程中釋放到環(huán)境中 [4, 5]。由于其普遍性和效力，內毒素被認為是最重要的熱原[6]。

與藥物相關(guān)的內毒素的一個(gè)問(wèn)題是它們具有熱穩定性，使其能夠抵抗大多數傳統的滅菌過(guò)程，因此需要對活細胞和內毒素進(jìn)行單獨的測試。。制藥工藝和設備面臨內毒素的風(fēng)險。因此，去熱原是在藥品制備過(guò)程中保持無(wú)菌保證的重要因素。有幾種不同的方法來(lái)實(shí)現去熱原（包括超濾、離子交換色譜和使用酸堿水解）?？梢哉f(shuō)，最常見(jiàn)的去熱原設備是那些使用干熱操作的設備（例如使用單向熱空氣的去熱原通道，用于準備初級包裝物品（產(chǎn)品小瓶）以進(jìn)行無(wú)菌灌裝[7]。

監管機構對去熱原的要求各不相同。歐洲藥典規定用于熱原測試的玻璃在 250°C 下干熱 30 分鐘，或在 200°C 下干熱 60 分鐘以進(jìn)行去熱原，但對于用于注射用的玻璃器皿的去熱原沒(méi)有書(shū)面要求 [8]。用于鱟試劑測試的玻璃器皿必須進(jìn)行去熱原處理，使其水平低于測試的靈敏度。USP<1211>和 FDA 指南不包含溫度規范，但要求內毒素從至少 1000個(gè)內毒素單位（EU）的起始濃度減少3對數（log），以進(jìn)行去熱原[9]。

就去熱原反應而言，干熱滅活時(shí)，內毒素遵循線(xiàn)性對數減少曲線(xiàn)，直至減少至3對數。這種破壞持續發(fā)生但不一定遵循線(xiàn)性回歸后，而是“雙相"減少[10]。

內毒素指示劑

使用內毒素指示劑評估內毒素的減少情況，所述內毒素指示劑使用源自大腸桿菌o113:H10的對照標準內毒素（CSE）制劑制備的。使用的CSE應類(lèi)似于使用鱟試劑（LAL）方法進(jìn)行常規細菌內毒素試驗（BET）所用的內毒素，并可追溯到參考標準。

細菌內毒素工作標準品(CSE)

行業(yè)內對如何制備內毒素指示劑存在一些爭議；制備內毒素指示劑的方法有兩種，一種是將內毒素添加到要去熱原的物品表面并將其烘干，另一種是使用預先制備好的內毒素指示劑來(lái)實(shí)現的。 在這兩種方法中，筆者更傾向于第一種方法。因為內毒素直接用于去熱原的設備表面[11]，這種方法被認為更具挑戰性。

二、研究設計

這項研究的目的是確定除干熱法外，是否還能用其他方法成功去除熱原。研究了兩種替代方法：濕熱（高壓滅菌）和苛性堿沖洗，并將結果與干熱去熱原進(jìn)行了比較。[12]

三、驗收標準

目前還沒(méi)有針對玻璃最終產(chǎn)品容器的藥典內毒素耐受限值 (K)，因此本研究采用了醫療器械的限值，即0.5EU/ml。

四、方法學(xué)

本研究選擇的方法為動(dòng)態(tài)濁度法LAL（鱟試劑）試驗（根據《歐洲藥典》<2.6.14>中的細菌內毒素試驗）。LAL試驗基于從鱟中分離出來(lái)的裂解酶，這種酶在內毒素存在的情況下會(huì )凝結成塊[3]。在實(shí)踐中，對于動(dòng)態(tài)濁度法試驗，LAL反應速率是用達到預定的“閾值"光密度所需的時(shí)間來(lái)表示的，稱(chēng)為起始時(shí)間[13]。內毒素濃度越高，起始時(shí)間越短。內毒素濃度是根據標準曲線(xiàn)（大腸桿菌內毒素標準）計算得出的，該曲線(xiàn)是通過(guò)對數起始時(shí)間與對數內毒素濃度的線(xiàn)性回歸計算得出的[14]。樣品、標準品和對照品至少進(jìn)行一式兩份的測試。陽(yáng)性產(chǎn)品對照回收率應在50-200%的范圍內。

這項研究使用了用注射用水沖洗過(guò)的玻璃瓶，制備了50000 EU/ml的內毒素溶液。用0.1ml溶液接種到小瓶中，得到理論上5000EU的加標值，并在單向氣流柜中風(fēng)干過(guò)夜。之所以選擇0.1 ml的接種量，是因為有文獻報道，較小的接種量可減少吸附，從而使小瓶中的內毒素回收率更高且更穩定。制備完成后，將內毒素指示劑與兩個(gè)陽(yáng)性對照一起放置在去熱原裝置中的指-定位置（10 個(gè)內毒素指示劑被認為足以評估去熱原能力）。

五、處理和測試

共進(jìn)行了三種處理：

1、干熱：將小瓶在250°C的Carbolite烘箱中處理30分鐘?！睹绹幍洹窡嵩瓬y試章節<151>中規定，在250°C下加熱不少于30分鐘以去除玻璃器皿和器具的熱原。

2、濕熱：將小瓶在121°C下高壓滅菌30分鐘；該高壓滅菌周期是用于對設備進(jìn)行消毒的標準循環(huán)。

3、苛性堿：每個(gè)小瓶用10ml的0.1 mol/L氫氧化鈉沖洗1分鐘。據文獻報道，這種濃度的苛性堿能夠去熱原[17]。進(jìn)行 1 分鐘的清洗是因為它是可行的，并且如果顯示成功的話(huà)可以很容易地實(shí)施和進(jìn)行。

除干熱外，每種處理均進(jìn)行三次運行，因為結果表明，前兩次運行后去熱原 100% 成功（正如已建立的成熟技術(shù)所預期的那樣）。

處理后，每個(gè)小瓶加入5ml緩沖液，并在超聲波浴中超聲處理15分鐘，然后放置在軌道振蕩器上直至測試。在測試之前，將所有瓶子渦旋混合一分鐘。文獻中建議將超聲波處理和渦流相結合，以實(shí)現最佳的內毒素回收率。

所有樣品均根據 5.0 EU/ml 至 0.005 EU/ml 范圍內的標準曲線(xiàn)進(jìn)行重復檢測。陽(yáng)性對照、濕熱處理后樣品和苛性堿處理后樣品需要稀釋?zhuān)允箍蓹z測的內毒素處于標準曲線(xiàn)的范圍內。每次檢測至少有一個(gè)處理過(guò)的樣品和所有對照組都加了 0.5 EU/ml 的內毒素。檢測樣品時(shí)，在裂解反應管中用 LAL 試劑水進(jìn)行 1:2 稀釋?zhuān)▽τ谛枰♂尩綐藴是€(xiàn)范圍內的樣品和對照組，在檢測過(guò)程中還需進(jìn)行 1:2 的稀釋?zhuān)?。對于?yáng)性產(chǎn)品對照，用1.0 EU/ml內毒素標準溶液進(jìn)行1:2稀釋?zhuān)玫脚c測試樣品相同的稀釋度，但內毒素加標量為0.5 EU/ml。陽(yáng)性產(chǎn)品對照加標回收率在50-200%之間表明沒(méi)有干擾，稀釋液適合測試。

六、結果

（一）數據分析

使用Microsoft Excel™和Systat 11™進(jìn)行數據分析。采用雙向方差分析來(lái)檢驗三種處理之間是否存在顯著(zhù)差異。使用學(xué)生t檢驗證實(shí)了差異。由于所測得的處理后內毒素濃度取決于每次運行的初始峰值，因此統計分析是根據內毒素減少對數而不是所測得的實(shí)際內毒素進(jìn)行的。這種方法降低了檢測到虛假意義的風(fēng)險，并且不假設數據來(lái)自同一人群。

統計分析表明，干熱是去熱原最-有-效的處理方法，比濕熱和堿處理更能顯著(zhù)降低內毒素。雖然干熱處理是最-有-效的方法，但濕熱處理和苛性堿處理后內毒素的平均對數下降值都是1.7，因此這兩種去熱原方法之間沒(méi)有顯著(zhù)差異。

（二）討論

這項研究檢驗了三種不同處理方法對玻璃器皿的去熱原效果。結果表明，干熱處理能穩定地去除所有加標瓶中的熱原，使內毒素減少 3 個(gè)以上的對數下降值。這是意料之中的，因為干熱是一種普遍接受的去熱原方法。

盡管對干熱破壞內毒素的機制尚未得到明確研究，但這可能是由于高溫導致分子不加選擇地焚燒造成的。 Ludwig和Avis [15] 認為這是一種以自由基為介質(zhì)的氧化反應，由生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的痕量金屬催化。這項研究表明，采用濕熱法，傳統的高壓滅菌循環(huán)在降低內毒素濃度方面的效果遠不如干熱法。所有經(jīng)過(guò)濕熱處理的瓶子都沒(méi)有達到 3-log的去熱原目標，而且所有測試瓶子的處理后內毒素含量都超過(guò)了4 EU/ml。內毒素的熱穩定性是眾-所-周-知的，傳統的高壓滅菌濕熱處理無(wú)法有效去除熱原。有報道稱(chēng)，在過(guò)氧化氫存在的情況下，通過(guò)高壓滅菌可成功去除熱原，這種情況下的破壞被認為是由于脂多糖脂質(zhì)A部分的脂肪酸被氧化所致[16]。 此外，長(cháng)時(shí)間的高壓滅菌也被證明可以成功地去除熱原。這些都是未來(lái)研究中可以探索的途徑，但這兩種方法對于一般實(shí)驗室來(lái)說(shuō)都不可行。

用氫氧化鈉處理加標瓶對內毒素有負面影響，然而，3-log去熱原目標無(wú)法始終如一地實(shí)現。雖然許多瓶子中的內毒素降至低于可接受限值的水平，但這種情況并不一致。應當注意，苛性堿的清洗是手工進(jìn)行的；因此，去熱原過(guò)程中的不一致性可能與可能與混合過(guò)程的變化有關(guān)。

苛性堿處理過(guò)程中的破壞機制是由于內毒素脂質(zhì)A部分中發(fā)現的酯和酰胺鍵的水解。酯鍵的堿性水解產(chǎn)生醇和酸式鹽稱(chēng)為皂化，加熱可增強皂化效果[17]。因此，通過(guò)在苛性堿處理中加入加熱階段，可能會(huì )更有效地減少內毒素。

七、結論

干熱被認為是-最有-效的去熱原方法，其效果明顯優(yōu)于濕熱和苛性堿處理法。因此，這項研究支持大多數文獻中的普遍結論。

干熱持續實(shí)現內毒素減少超過(guò) 3個(gè)對數級。本研究中的濕熱和堿處理方案不能一致地去熱原。與干熱相比，這兩種替代方法都沒(méi)有達到相同的可量化的內毒素破壞水平。

本研究中使用的玻璃瓶在處理前已用注射用水沖洗過(guò)。購買(mǎi)的玻璃瓶通常含有雜質(zhì)，需要沖洗?；厥盏牟Ａ髅罂赡苡谢瘜W(xué)和生物沉淀物，可能會(huì )扭曲或掩蓋殘留的內毒素。

這些雜質(zhì)和殘留物可能會(huì )影響玻璃的去熱原處理，應在處理前將其去除；因此，有必要制定玻璃器皿去熱原處理的準備程序。采取措施減少內毒素是微生物控制的一個(gè)重要部分，這涉及到藥品加工以及需要制備材料或測試成分的實(shí)驗室。這與內毒素的風(fēng)險有關(guān)。內毒素注射后的病理效應是核心體溫迅速升高，隨后出現極快和嚴重的休克，往往在診斷出病因之前就已經(jīng)死亡[18]。

參考文獻

1.Akers,M.J.,Ketron,K.M.andThompson,B.R.(1982):‘F Value Requirements for the Destruction of Endotoxin in the Validation of Dry Heat Sterilization / Depyrogenation Cycles’, Journal of Parenteral Science and Technology, Vol. 36, No1, January-February 1982, pp23-27

2.Baines, A. (2000): ‘Endotoxin Testing’ in Baird, R. M., Hodges, N. A. and Denyer, S. P. Handbook of microbiological Quality Control, Taylor & Francis, pp144-167

3.Williams, K.L. (2001). Endotoxins: Pyrogens, LAL testing and Depyrogenation 2nd Edition. Drugs and the Pharmaceutical Sciences Volume 111. Marcel Dekker Inc., New York, USA. Chapters 1, 2, 7 & 8.

4.Hecker, W., Witthauser, D. & Staerk, A. (1994). Validation of dry heat inactivation of bacteria endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 48 (4): 197-204.

5.Rietschel, E.T. & Brade, H. (1992). Bacterial Endotoxins. Scientific American August 1992: 26-33

6.Cooper, J.F. (2001). The bacterial endotoxins test: past, present and future. European Journal of Parenteral Sciences 6 (3): 89-93

7.Baird, R. (1988): ‘Validation of Dry Heat Tunnels and Ovens’, Pharmaceutical Engineering, Vol. 8, No.2, pp31-33

8.Guy, D. (2003): ‘Endotoxins and Depyrogenation’ in Hodges, N. and Hanlon, G., Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls, Euromed, pp12.1 – 12.15

9.Sandle, T. (2004). Three aspects of LAL testing: Glucans, depyrogenation and water system qualification. PharMIG News 16: 3-12

10.Nakata, T. (1993): ‘Destruction of typical endotoxins by dry heat as determined using LAL assay and pyrogen assay’, J Parenter Sci Technol, Sep-Oct;47(5):258-64

11.Sandle, T. (2011): “A Practical Approach to Depyrogenation Studies using Bacterial Endotoxin", Journal of GXP Compliance, Autumn 2011

12.Plant, I. (1993): ‘Destruction of typical endotoxins by dry heat as determined using LAL assay and pyrogen assay’, J Parenter Sci Technol, Sep-Oct;47(5):258-64

13.Cooper, M.S. (1996). Bacterial Endotoxins. The Microbiological Update 14 (1): 1-4

14.Novitsky, T.J. (1996). Limulus amebocyte lysate (LAL) assays in Automated Microbia

15.Ludwig, J.D. and Avis, K.E. (1990). Dry heat inactivation of endotoxin on the surface of glass. Journal of Parenteral Science and Technology 44 (1): 4- 12

16.Weary, M. & Pearson, F. (1988). A manufacturers guide to depyrogenation. Biopharm 1 (4): 22-29

17.Caroff, M. & Kariban, D. (2003). Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research 338: 2431-2447

18.Tours, N. and Sandle, T. Comparison of dry-heat depyrogenation using three different types of Gram-negative bacterial endotoxin, European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences, Volume 13, No-1, 2008, pp17-20+