創(chuàng )建用于內毒素加標研究和LAL樣品保持時(shí)間分析的內部天然內毒素制劑

摘要

檢測生物制藥產(chǎn)品中可能存在的內毒素對患者安全至關(guān)重要。雖然內毒素分子本身是高度穩定的，但基質(zhì)成分、儲存溫度和容器組成等各種因素都會(huì )影響其在制造收集并隨后檢測內毒素含量的樣品時(shí)的穩定性。

位于馬薩諸塞州安多弗的輝瑞制藥公司開(kāi)發(fā)了一個(gè)程序，用于創(chuàng )建內部天然內毒素（NOE）制劑，以評估內毒素在不同基質(zhì)、溫度和容器中的穩定性。使用NOE比使用市售的細菌內毒素工作標準品（CSE）更有優(yōu)勢，如增加實(shí)驗室的靈活性和控制，輝瑞公司已使用內部天然內毒素（NOE）制劑來(lái)評估內毒素在不同基質(zhì)和溫度下的穩定性。

介紹

內毒素是一種脂多糖結構，位于革蘭氏陰性細菌的細胞壁中。由于內毒素屬于一類(lèi)被稱(chēng)為熱原的致熱物質(zhì)，因此可能含有內毒素的腸外用藥產(chǎn)品會(huì )引起患者的熱原反應。

FDA規定的內毒素限值為5EU/kg體重。超過(guò)此含量的內毒素限值可能會(huì )導致發(fā)燒、休克和死亡。出于安全性和合規性的考慮，在生物制造過(guò)程和產(chǎn)品中監測和控制內毒素含量至關(guān)重要。

鱟試劑（LAL）檢測法通常用于檢測生物制品中的內毒素含量。檢測貫穿于整個(gè)純化過(guò)程以及原料藥和成品藥生產(chǎn)過(guò)程的各個(gè)環(huán)節。有效的內毒素檢測對于產(chǎn)品的安全性非常重要。因此，準確檢測產(chǎn)品生產(chǎn)和釋放過(guò)程中可能存在的任何內毒素至關(guān)重要。

盡管人們普遍認為內毒素分子本身具有高度穩定性，但各種基質(zhì)、溫度和/或儲存容器都可能影響鱟試劑（LAL）檢測法檢測內毒素存在的能力。在馬薩諸塞州安多弗的輝瑞專(zhuān)科護理中心啟動(dòng)了多項研究來(lái)探討這些影響。 為了測量時(shí)間和/或溫度對內毒素回收的影響，有必要在起始生物制藥樣品中加入內毒素。由于要對多種基質(zhì)和溫度進(jìn)行評估，因此需要大量的內毒素才能完成這些研究。

細菌內毒素工作標準品（CSE）是一種商業(yè)上可用的內毒素類(lèi)型。CSE用于為鱟試劑（LAL）檢測法準備標準曲線(xiàn)和陽(yáng)性產(chǎn)品對照（PPC）。CSE由獲得許可的鱟試劑供應商從純化的大腸桿菌菌株中制備，并在配方中含有填充劑。因此，CSE并不代表實(shí)際污染事件中可能存在的內毒素。此外，CSE通常不適用于高濃度的EU/mL配方。

自然產(chǎn)生的內毒素（NOE）由革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生，經(jīng)過(guò)過(guò)濾但未經(jīng)進(jìn)一步處理，使其成為污染事件的代表性物質(zhì)。此外，由于它可以培養到非常高的EU/mL濃度，因此適合用于加標研究。

生物體的選擇

對多種革蘭氏陰性生物體進(jìn)行篩選以產(chǎn)生NOE，以確定用于產(chǎn)生NOE制劑的潛在候選物。所有NOE溶液均通過(guò)在胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）上制備草坪培養物并在32°C下孵育24-48小時(shí)來(lái)制備。從培養皿中取出菌落，接種到胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，在32°C的振蕩培養箱中培養過(guò)夜。將所得培養物離心，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，并使用動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑檢測內毒素。表1-1列出了所評估的每種生物的EU/mL值。

先前在馬薩諸塞州安多佛的輝瑞公司基地使用大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌制劑進(jìn)行的NOE加標研究非常有用，因為它們產(chǎn)生了高濃度的EU/mL儲備溶液，并且在很長(cháng)一段時(shí)間內保持穩定。產(chǎn)生高濃度內毒素的生物體特別適用于加標研究，因為這些制劑可以靈活地測試低和高的加標濃度。

由于這些制劑產(chǎn)生的內毒素濃度遠遠高于常規使用時(shí)的水平，因此每次使用前都必須確認實(shí)驗室制備的NOE儲存液的濃度，以便制備準確的加標溶液。

LAL驗證與LAL加標研究

在產(chǎn)品生產(chǎn)和發(fā)布過(guò)程中對LAL檢測進(jìn)行常規使用驗證時(shí)，會(huì )將CSE形式的內毒素作為PPC添加到已稀釋的樣品中，以評估基質(zhì)抑制/增強作用。驗證活動(dòng)重點(diǎn)關(guān)注干擾因素測試，通過(guò)確定PPC加標回收率（即，加標到PPC中的內毒素的回收率必須達到 50-200%）來(lái)評估樣品基質(zhì)是否會(huì )干擾內毒素檢測。當加標回收率在可接受的PPC加標回收范圍內，并且與USP第<85>章中設定的參數一致時(shí)，選擇樣品稀釋。

LAL驗證研究的設計通常會(huì )考慮到樣品基質(zhì)的影響，即樣品稀釋到一定程度后，檢測中不再出現干擾，這是由稀釋樣品中PPC加標回收率決定的。在這種情況下，PPC中的內毒素只有在稀釋后才會(huì )與樣品發(fā)生作用，而不是在開(kāi)始時(shí)。

為了確定樣品基質(zhì)對內毒素的影響，在進(jìn)行常規LAL檢測之前，內毒素必須與未稀釋的樣品基質(zhì)相互作用。

使用NOE最初加標未稀釋的樣品更能代表污染事件，因為這種污染的來(lái)源很可能是細菌來(lái)源，而不是來(lái)自加工后的內毒素來(lái)源（如CSE）。

PPC加標和NOE加標的作用之間的主要區別在于，PPC加標提供有關(guān)樣品基質(zhì)是否干擾檢測本身的檢測措施的信息，而NOE加標提供有關(guān)樣品基質(zhì)與內毒素直接相互作用的信息。圖1說(shuō)明了使用動(dòng)力學(xué)LAL檢測法進(jìn)行常規檢測和NOE加標研究之間的區別。

保持時(shí)間研究的設計

在許多情況下，LAL樣品運到檢測實(shí)驗室后，要放置一段時(shí)間才能開(kāi)始檢測。應進(jìn)行研究，以評估該保持時(shí)間對特定樣品類(lèi)型內毒素回收的影響。NOE對于這些研究非常有用，因為實(shí)驗室可以很容易地制備和儲存高濃度的EU/mL儲存液，從而可以相對簡(jiǎn)單地制備出各種內毒素濃度的加標樣品。

在進(jìn)行LAL檢測之前，通過(guò)在未稀釋的樣品中添加NOE來(lái)進(jìn)行保持時(shí)間研究。立即對加標樣品進(jìn)行分析以確定起始濃度，并在設定的時(shí)間點(diǎn)儲存和分析等分試樣。通過(guò)在未稀釋的樣品中加入NOE，可以在初始時(shí)間點(diǎn)以及樣品的儲存時(shí)間和溫度下確定產(chǎn)品和基質(zhì)對可能存在的任何內毒素的影響。在這些研究中使用動(dòng)力學(xué)LAL測定法，因為結果是定量的，可以確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的內毒素量。

表1-2顯示了在2-8°C溫度下將兩種不同的緩沖液保持3周時(shí)，使用摻入NOE的兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結果，表1-3顯示了在-80°C溫度下，將兩種緩沖液保持3個(gè)月時(shí)，使用摻入相同兩種緩沖液進(jìn)行保持時(shí)間研究的結果。這些結果表明，無(wú)論在何種溫度下，內毒素都可以從緩沖基質(zhì)中回收。

保持時(shí)間研究的一個(gè)重要考慮因素是確認最初加入的內毒素量。當NOE加入后直接測定起始時(shí)間點(diǎn)時(shí)，必須考慮樣品基質(zhì)是否對內毒素回收率有直接影響。為了證明沒(méi)有樣品基質(zhì)干擾，在無(wú)熱原水（LRW） 中進(jìn)行了相同的加標。表1-4說(shuō)明了此無(wú)熱原水加標確認的使用情況。本研究使用了三種不同的NOE加標水平，由目標NOE加標量表示。測試樣品和無(wú)熱原水欄下的實(shí)際回收量在LAL測定可變范圍內，且表明不存在樣品基質(zhì)的干擾。

起始時(shí)間點(diǎn)測試和使用NOE進(jìn)行故障排除

以下研究（表1-5）清楚地說(shuō)明了在無(wú)熱原水中對起始時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行加標確認的重要性。將NOE加標到測試樣品中并立即進(jìn)行測定以確定起始NOE濃度。NOE以三種不同的濃度加標，由目標NOE加標表示。在所有三種加標水平的稀釋度測試中，內毒素回收率均低于檢測限值。然而，由于沒(méi)有進(jìn)行無(wú)熱原水確認，因此很難確定是否存在稀釋或測定誤差，或實(shí)際的基質(zhì)或產(chǎn)品干擾。

這項研究以?xún)煞N不同的加標水平重復進(jìn)行，無(wú)熱原水確認樣品與測試樣品同時(shí)進(jìn)行（表1-6）。添加無(wú)熱原水確認樣品清楚地表明，樣品基質(zhì)存在干擾，導致檢測樣品中無(wú)法檢測到內毒素。

在這種情況下，需要進(jìn)行多項研究來(lái)確定樣品基質(zhì)干擾的原因。 使用實(shí)驗室制備的NOE儲存液提高了實(shí)驗室在短時(shí)間內進(jìn)行多項研究的效率，并允許使用從5EU/mL到3500 EU/mL的加標濃度。表1-7顯示了一項使用不同測試樣本的研究數據，該樣本的 NOE加標非常低（5-40 EU/mL）。在這種情況下，測試樣本和無(wú)熱原水確認樣本的內毒素回收率是一致的，表明沒(méi)有基質(zhì)干擾。

研究人員還使用了來(lái)自幾種不同生物的制備物，為收集到的數據增加了穩定性和可變性。這突出了使用內部NOE制備物的額外好處，因為來(lái)自多種生物的制劑可以在需要時(shí)快速制備和使用。

表1-8顯示了使用表1-5和表1-6中的相同測試樣本生成的部分數據，其中有來(lái)自高濃度EU/mL NOE生成物（粘質(zhì)鏈霉菌）和低濃度EU/mL NOE生成物（A. 基因組）的加標。 兩者的目標濃度均為200 EU/mL，并顯示出相似的回收率，進(jìn)一步表明測試樣品干擾了內毒素的回收，而不是任何檢測錯誤或特定內毒素來(lái)源的問(wèn)題。

結論

本報告中提供的數據用于說(shuō)明測試各種基質(zhì)、溫度和儲存時(shí)間對在測試前將在實(shí)驗室中放置一段時(shí)間的樣品的內毒素回收的干擾的重要性。了解內毒素和樣品基質(zhì)在起始時(shí)間點(diǎn)的相互作用尤為重要，因為此時(shí)可能存在的任何基質(zhì)抑制都會(huì )被識別。在執行此測試或對在NOE被摻入測試樣品基質(zhì)時(shí)表現出抑制的基質(zhì)進(jìn)行故障排除時(shí)，使用實(shí)驗室制備的NOE原液大大增加了可用的測試選項的靈活性、效率和范圍。當在起始時(shí)間點(diǎn)遇到基質(zhì)抑制時(shí)，需要開(kāi)發(fā)替代測試方法，在這種情況下NOE也非常有用，因為確認內毒素是否成功回收對于任何替代方法的實(shí)施都至關(guān)重要。