生物制藥生產(chǎn)商對內毒素有兩個(gè)擔憂(yōu)。首先，注射成品中的內毒素含量必須低于內毒素限值。這一問(wèn)題適用于所有注射藥物、生物制品和無(wú)熱原醫療器械。這方面的文獻記載很多，本文不再討論。第二個(gè)問(wèn)題是內毒素對用于生產(chǎn)生物制藥的表達系統和產(chǎn)品本身的影響。

內毒素對不同細胞類(lèi)型或細胞系的影響差別很大。我們應該了解內毒素對相關(guān)細胞的影響，以便采取適當的控制措施。即使是母細胞系和子細胞系，對內毒素的敏感性也可能大相徑庭。1對所用的細胞表面受體的認識可以提醒研究者注意潛在的內毒素敏感性。人體細胞上的CD14受體與內毒素敏感性密切相關(guān)。2當培養基中含有血清時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。血清成分，如脂多糖結合蛋白（LBP）和septin復合物，可增強CD14細胞對內毒素的激活作用。3,4相反，一些哺乳動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的細胞系統對內毒素具有耐受性。細菌和酵母培養基中內毒素的存在通常不是一個(gè)問(wèn)題。下文將舉例說(shuō)明內毒素對生物系統的影響。

在涉及細胞培養的研究中，必須防止因生物對污染物的反應而產(chǎn)生的虛假結果。此外，還必須將產(chǎn)物的特性與污染物內毒素的特性區分開(kāi)來(lái)，細胞因子尤其如此。

一、膜和形態(tài)學(xué)效應

內毒素是革蘭氏陰性菌的兩親性膜成分。它可能會(huì )干擾其他細胞的膜結構和功能，這并不奇怪。內毒素通過(guò)磷酸基團與陽(yáng)離子蛋白質(zhì)發(fā)生反應，其脂肪酸鏈則與脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)的親水區發(fā)生作用。內毒素與細胞膜的相互作用可能表現為明顯的形態(tài)學(xué)變化，如中國倉鼠卵巢細胞膜紊亂、5表面褶皺和細胞器增多、6細胞質(zhì)中出現大液泡、7形態(tài)學(xué)損傷和己糖攝取減少、8和嚴重的膜損傷。9有時(shí)形態(tài)變化暴露于清潔介質(zhì)后是可逆的。10此外，不同的內毒素對形態(tài)學(xué)的影響也不同。11

情況嚴重的話(huà)，內毒素對細胞膜結構和功能的影響可能具有細胞毒性。不同內毒素12和不同細胞系之間的毒性程度各不相同。13然而，至少有一些細胞可能誘導對內毒素的耐受性。14

二、分泌/生產(chǎn)

細胞膜對細胞產(chǎn)物的合成至關(guān)重要，內毒素會(huì )影響這一合成過(guò)程。這顯然是細胞研究和商業(yè)細胞系開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題。細胞的敏感性是多種多樣的；例如，從內毒素反應親本中克隆了兩種無(wú)反應的T細胞系。15此外，內毒素的反應可能會(huì )受到其他因素的影響，如溫度。16

內毒素對體外單細胞產(chǎn)生細胞因子的影響已被廣泛報道。內毒素被認為是腫瘤壞死因子（TNF）產(chǎn)生的有效刺激物。17已經(jīng)注意到對轉錄的影響，18,19,20,21并且已經(jīng)提出刺激的主要調節可能發(fā)生在這個(gè)水平上。22

除細胞因子外，一系列細胞產(chǎn)物也受到內毒素的影響。哺乳動(dòng)物細胞合成受到刺激或增強的產(chǎn)物包括前列腺素、23酸性磷酸酶、6纖維蛋白溶解抑制劑、24膠原酶生成、25神經(jīng)生長(cháng)因子、26B因子分泌、27多肽、28血小板激活因子、29粘附抑制劑、30粘附分子-131和促凝劑（劑量依賴(lài)性）。

已觀(guān)察到內毒素對血管緊張素轉換酶活性33、蛋白多糖23和α2 巨球蛋白34的合成有抑制作用。這些反應可能與劑量有關(guān)，在某些情況下，不同的內毒素會(huì )產(chǎn)生不同的反應。例如，在某些劑量下，乳桿菌內毒素會(huì )刺激磷酸酶的產(chǎn)生，而大腸桿菌內毒素則會(huì )抑制磷酸酶的產(chǎn)生。11

三、有絲分裂

內毒素對某些哺乳動(dòng)物細胞類(lèi)型和品系具有強烈的有絲分裂作用。這種效應會(huì )給易感細胞的培養帶來(lái)問(wèn)題。另一方面，一些歷史悠久的細胞系對培養基中的高濃度內毒素具有耐受性。有報道稱(chēng)，有絲分裂性與幾種不同內毒素的LAL反應性和熱原性之間存在相關(guān)性。35然而，正相關(guān)性并不總是很明顯，同樣有絲分裂性的內毒素在LAL反應性和熱原性方面可能存在顯著(zhù)差異。36因此，LAL活性不是內毒素有絲分裂性的良好預測指標。37

一些有絲分裂原受到內毒素的嚴重污染（表1），其高濃度使人懷疑內毒素對其有絲分裂作用的影響。有報道稱(chēng)，內毒素和有絲分裂的作用具有相似性。38

Concanavalin A（刀豆凝集素A ）

Pokeweed mitogen（美洲商陸有絲分裂原）

表1.兩種有絲分裂原種的內毒素濃度39

更為復雜的是，內毒素可以抑制細胞分裂，與刺激有絲分裂一樣，這些作用取決于內毒素的來(lái)源。40可能存在濃度依賴(lài)性效應，從促進(jìn)有絲分裂到抑制更高濃度的有絲分裂。值得注意的是，一些常用有絲分裂中的內毒素濃度與某些細胞系中抑制細胞分裂的內毒素濃度一樣高。

四、其他影響

文獻中報道的內毒素對其他體外細胞的其他影響包括：影響粘附性、41胰島素結合和內吞作用的減少、42TNF結合位點(diǎn)的喪失、43保護細胞免受HIV感染、44殺瘤活性45以及鉀電流和鉀通道數量的增加。46

五、多重效應和協(xié)同作用

內毒素引起的多種生物反應可能造成因果關(guān)系的混亂。內毒素對細胞產(chǎn)物分泌的影響可能是間接的。例如，干擾素抗體可阻止內毒素對彈性蛋白酶分泌的明顯抑制作用。這表明細胞產(chǎn)生的干擾素導致了抑制作用。在抗體存在的情況下，內毒素實(shí)際上增加了彈性蛋白酶的分泌。因此，抑制作用是繼發(fā)性的，是由于內毒素刺激了干擾素的產(chǎn)生。47

同樣，培養的心臟細胞產(chǎn)生的脂肪酶產(chǎn)生80%的抑制作用是由細胞產(chǎn)生的內毒素誘導的TNF介導的。48這些觀(guān)察結果是一個(gè)明確的警告，觀(guān)察到的影響可能是內毒素暴露的間接后果。類(lèi)似地，有絲分裂性可能是次要效應。內毒素刺激巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生IL-1已被證明在脾臟細胞中有致裂作用。49在這種情況下，這種作用是由牙齦擬桿菌的內毒素引起的，而不是由腸道細菌引起的。淋巴因子和內毒素之間有趣的協(xié)同作用可誘導巨噬細胞產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，這種反應已被建議作為細胞毒性試驗的替代品。50

在另一項研究中，內毒素與細胞因子在同一系統中既有協(xié)同作用，也有拮抗作用。51粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子使細胞對內毒素產(chǎn)生反應，從而誘導TNF的產(chǎn)生。TNF刺激lL-6的產(chǎn)生，從而在負反饋循環(huán)中抑制TNF的進(jìn)一步產(chǎn)生。

六、體外受精

體外受精是組織培養技術(shù)的一種特殊應用。在低內毒素濃度的培養基中可以提高受精率。52在培養基中檢測不到內毒素的情況下（檢測限為0.1ng/ml），懷孕率為27.2%，而在含有內毒素的情況下，懷孕率僅為6.3%。內毒素存在時(shí)，形態(tài)學(xué)和超微結構發(fā)生明顯變化。在另一項研究中，53在內毒素濃度高于1ng/ml時(shí)，觀(guān)察到孕體中碎片的程度不斷增加。當內毒素濃度低于1ng/ml時(shí)，卵母細胞受精率為66%，而當內毒素濃度大于1ng/ml的時(shí)候，受精率為53%。比較妊娠情況時(shí)，差異更為明顯。當培養基中內毒素濃度超過(guò)1ng/ml時(shí)，妊娠率為8%，未檢測到內毒素（0.1ng/ml）時(shí)，妊娠率為32%。

七、結論

由于細胞對內毒素的反應千差萬(wàn)別，因此無(wú)法確定內毒素開(kāi)始干擾細胞功能和生長(cháng)的臨界水平，也不可能說(shuō)明這種干擾可能采取的形式。內毒素的影響和所討論的細胞的敏感性只能通過(guò)在沒(méi)有可檢測到的內毒素的培養基中培養細胞來(lái)確定。這可能可行，也可能不可行。如果可行，可以確定臨界污染水平并設定限制。

人們早已認識到內毒素對細胞過(guò)程的影響。由于血清在細胞培養基中的廣泛使用54，人們對血清的內毒素污染給予了特別關(guān)注。Fumarola和Jirillo55,56強烈呼吁人們認識到內毒素對細胞系的影響，以及適當降低內毒素濃度的必要性。他們指出，“生物學(xué)中常用的一些制劑受到內毒素污染，可能會(huì )產(chǎn)生錯誤的結果。"至少有一種說(shuō)法認為組織培養基中“絕對不存在"內毒素。57這些作者還討論了使用內毒素刺激細胞并提高其反應性的問(wèn)題，但顯然是以受控的方式。

應盡量減少產(chǎn)品的內毒素污染，而不僅僅是因為擔心熱原性和內毒素限值。一些生物技術(shù)產(chǎn)品的特性是與內毒素相同的。58如果制劑被內毒素污染，就無(wú)法對這些產(chǎn)品進(jìn)行適當評估。研究人員使用End-X B15內毒素親和樹(shù)脂（美國ACC）的經(jīng)驗很好地說(shuō)明了這一點(diǎn)。從蛋白質(zhì)溶液中成功地去除了內毒素，遠低于令人擔憂(yōu)的水平，該蛋白質(zhì)的特異酶活性不受處理的影響。然而，該制劑的有絲分裂活性卻急劇下降。研究人員最終得出結論，原始制劑的有絲分裂性可能是由于大量?jì)榷舅匚廴驹斐傻?，而不是蛋白質(zhì)的固有特性。

內毒素污染的問(wèn)題應該在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的早期解決，當然也應該在擴大規模之前解決。這樣既能最大限度地減少有害影響，又能正確確定產(chǎn)品的特性，對內毒素相關(guān)問(wèn)題的及早關(guān)注可能會(huì )持續到全面生產(chǎn)。當內毒素規范對生物制藥和傳統生產(chǎn)的治療方法同樣重要時(shí)，這將有利于最終釋放測試。

參考文獻