選擇性清除內毒素的方法：吸附技術(shù)之親和吸附

通過(guò)內毒素選擇性親和吸附劑來(lái)清除內毒素應該是可能的，并能保證蛋白質(zhì)幾乎100%回收。為了清除不同細菌和菌株來(lái)源的內毒素，所采用的吸附劑必須與內毒素的化學(xué)結構能較好地匹配，所以應選用針對內毒素共有基團的選擇性親和配體，以識別內毒素的保守結構成分，這對于那些未知種類(lèi)的內毒素大多也是可以成功的。

1.多黏菌素B

多黏菌素B的抗菌活性針對革蘭陰性細菌，通過(guò)插入細菌的細胞壁，降解破壞細菌胞壁，其表面的活性環(huán)行肽能打破內毒素聚合物。由于多黏菌素B和脂質(zhì)A之間能相互作用，所以它是一個(gè)能識別不同來(lái)源內毒素的基團選擇性配體。在各種被污染的革蘭陰性細菌培養濾液中（1～10mg/L），用多黏菌素B作為吸附配體，清除因素超過(guò)105。Talmadge和Siebert對此進(jìn)行了分批試驗，結果顯示在有10g/L的BSA或人IgG存在情況下輸入6000~6700EU/ml（≈0.6～0.7mg/L）濃度的內毒素，使接觸時(shí)間為16h，其清除因素大約為103左右，且只能在此水平上下輕微改變。而對不同的單克隆抗體溶液，內毒素的清除因素明顯不同。如抗馬過(guò)氧化物酶抗體和抗人絨毛膜促性腺激素抗體（濃度分別為2.1g/L對20EU/ml內毒素和0.5g/L對61EU/ml內毒素），在20mmol/L磷酸緩沖液（pH6.5）中，內毒素分別被清除到0.3EU/ml和6EU/ml，清除因素分別約為100和10。

有研究者報道，從小牛過(guò)氧化氫酶中清除內毒素的清除因素超過(guò)1000。內毒素血癥患者的血漿也可以用此方法，洗脫下來(lái)的物質(zhì)主要是具有神經(jīng)毒性和腎毒性的多黏菌素B以及單核細胞刺激釋放的IL-1。此外，在流經(jīng)多黏菌素B層析柱時(shí)蛋白質(zhì)也會(huì )丟失，比如過(guò)氧化氫酶丟失24%，BSA丟失20%。這是由于這些配體具有陽(yáng)離子特性而與帶負電荷的蛋白質(zhì)發(fā)生電荷間相互作用的結果，這也是為什么即使從DNA質(zhì)粒預備物中可去除200～10000倍的內毒素而DNA的回收率卻僅約50%的原因。

2.組胺和組胺酸

早在1968年Kanoh等就曾將組胺和組胺酸用作了配體，他們發(fā)現，核苷酸和內毒素間有相互作用。后來(lái)，在1982年，Minobe等也發(fā)現除腺嘌呤、胞喀啶等核苷酸堿基外，組胺和組胺酸也能同樣成功地使內毒素從各種微生物培養過(guò)濾液中去除。雖然，組胺是一種良好的吸附劑，但它們隨后轉變成組胺酸時(shí)才真正具備生物活性。組胺和組胺酸用作內毒素的吸附劑與多黏菌素B同樣能有效對各種蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行去污染，包括血清白蛋白、胰島素、溶菌酶、肌紅蛋白和另外一些清除因素在5～200（主要因蛋白質(zhì)含量和環(huán)境條件而異）之間的物質(zhì)。

1990年，Matsumae等報道了有關(guān)分別檢測產(chǎn)物回收情況和內毒素去除情況的數據，發(fā)現在與多黏菌素B同時(shí)存在時(shí)，不能很好地獨立檢測到蛋白質(zhì)的恢復和內毒素的去除情況。其他實(shí)驗室的數據顯示，蛋白質(zhì)的存在對于內毒素的去除有很大的影響，比如在有BSA存在的時(shí)候，內毒素的清除因素減少超過(guò)10倍以上；在有鼠IgG1（PI=5.5）存在的情況下，如果是在中性環(huán)境里，清除內毒素根本就無(wú)效。同樣，緩沖鹽溶液對清除效果也是有一定影響的。

Minobe等采用了各種配體進(jìn)行內毒素的清除，雖然它們的去除效果相似，但化學(xué)結構卻十分不同。他們認為，內毒素結合的機制可歸因于疏水作用和電荷作用的協(xié)同，主要是具有腔隙（space）的二氨乙烷（DAH）和咪唑的作用。組胺和組胺酸在這種吸附功能下并不必要。DAH腔隙自身也是有效的吸附物質(zhì)，在一種以聚乙烯醇（PVA）為基礎的膜系統支持下，對含有1130EU/ml內毒素的10%細胞色素c溶液和含85EU/ml內毒素的20%HAS溶液去污染，內毒素分別被去除5000倍和100倍。另外，有人也證實(shí)DAH和其他一些二氨鏈烷類(lèi)對內毒素的有效吸附是由于離子間作用和疏水作用協(xié)同起作用的，但他們沒(méi)有提供有關(guān)從蛋白質(zhì)溶液中清除內毒素的數據。Petsch等于1997年發(fā)現，組胺酸配體的功能與其咪唑環(huán)上所帶的正電荷有關(guān)。如果在一個(gè)不帶正電荷的環(huán)氧乙烷諳腔隙混合情況下，只有在pH值≤5的時(shí)候才有明顯的清除效果，此時(shí)咪唑環(huán)已被解離（pKI=6.0）。

3.多陽(yáng)離子配體

從分子動(dòng)力學(xué)方面來(lái)看，與蛋白質(zhì)相比，有三維結構的內毒素是相當穩定的，這在吸附過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用。有資料顯示，雖然吸附在0.5mol/L的NaCl溶液中被有效抑制，但仍有一小部分內毒素在高鹽濃度環(huán)境下（濃度>1mol/L的NaCl溶液）被吸附。配體和內毒素由于長(cháng)距離的電荷作用而隨后產(chǎn)生短距離的相互作用是可能發(fā)生的。次級結合是在內毒素改變結構以適合于吸附劑表面的超微結構后通過(guò)另外的范德華力和氫鍵而實(shí)現的。用作內毒素吸附的吸附劑只有在某種嚴格的條件下（30%的乙醇加上1mol/LNaOH）才能成功地被清潔。這一點(diǎn)提示，在親和配體和內毒素之間準確的結構匹配并不必要。由此可見(jiàn)，內毒素選擇性配體應與多離子分子疏水部分的特性相符合。

事實(shí)上，一些陽(yáng)離子多聚體已成功地被用作配體（如圖35-2）。Mitzner等采用聚乙二胺（PEI）固定在纖維素小滴上，在體外從血清中清除內毒素，與多黏菌素B在生物超級相容性方面有相似的作用。與組胺不固定的纖維相比，PEI不固定在纖維素上，故可較多地從BSA溶液中去除內毒素，此時(shí)對離子作用力的依賴(lài)較少。肌球蛋白、γ球蛋白和細胞色素c溶液幾乎能完-全清除內毒素（達95%以上），最終內毒素僅留下≤0.05μg/L，同時(shí)有98%的蛋白質(zhì)可被保存下來(lái)。

與配體組胺、組胺酸、多黏菌素B和DEAE在一個(gè)較高的蛋白質(zhì)保存水平上相比，多聚L-賴(lài)氨酸（PLL）表現出略好的從BSA溶液中清除小量?jì)榷舅氐哪芰?。與DEAE離子交換相比，PLL吸附劑在蛋白質(zhì)結合能力耗盡之后仍是有用的。與多聚L-組氨酸（PLH）和多黏菌素B相比，用高相對分子質(zhì)量的PLL（相對分子質(zhì)量為150000~300000）預包裹的微板能更好地促進(jìn)與內毒素的結合。

最近，Hirayama等進(jìn)一步將PLL引入一種多聚基質(zhì)中從而改變常規用的多聚基質(zhì)，他們認為可能有更好的效果。Karl等報道，無(wú)鎬固定的PLH比表面固定有鎬的PLH更能促進(jìn)從BSA溶液中去除內毒素。PLH是一種相當昂貴的配體，在堿性環(huán)境（O.1mol/LNaOH）下不穩定。

多陽(yáng)離子與內毒素間相互作用的原理可能與細胞和細胞碎片間的絮凝作用相類(lèi)似。在絮狀沉淀反應開(kāi)始時(shí)，多陽(yáng)離子-多陰離子復合物形成，然后進(jìn)行水分子的替代，最后形成絮狀物，這個(gè)過(guò)程也被稱(chēng)為復雜凝聚。如果這個(gè)過(guò)程也發(fā)生于不固定的多聚陽(yáng)離子和內毒素時(shí)，復合物也會(huì )從溶液中析出來(lái)。這就解釋了在這些吸附劑和選擇性陽(yáng)離子配體蛋白質(zhì)的熱力學(xué)實(shí)驗中觀(guān)察到的其結合位點(diǎn)的高親和力現象。

4.具有陽(yáng)離予功能基團的聚基質(zhì)

Hirauyama等用了三年的時(shí)間發(fā)現，通過(guò)球形多孔的聚γ-甲基-L-谷氨酸作為吸附劑，比以組胺酸和聚氨基葡萄糖為基礎的市售內毒素吸附劑有更強的內毒素結合能力，而且較少依靠離子力（工作范圍也相應增加至0.4mol/LNaCl），并對BSA的選擇性更好。此外，通過(guò)改變反應條件而形成帶有小孔的珠狀形式可以阻止蛋白質(zhì)滲透至孔系統，這樣便可獲得高回收量的帶負電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)，同時(shí)內毒素也被強力吸附。作者由此得出結論：高效的內毒素清除能力是由于內毒素聚合物牢固地吸附于吸附劑表面，而BSA與吸附劑的結合能力相當低所致。

帶電荷的功能性基團固定于側鏈上使得酯鍵的化學(xué)活性不穩定是相當不利的，所以原位清除（CIP）在pH值高或低的情況下都不適合。N，N-二甲胺丙-腈/N-丙烯胺的應用是近年來(lái)新興起的。改變這兩種單體的比例可以調節電荷的密度，或者改變珠形物的孔徑都是對內毒素的清除有利的。在溶液pH值=7，μ=0.05的條件下，通常內毒素的去除可以達到96%～99%，0.5g/L BSA中的殘余內毒素的量小于1EU/ml，肌球蛋白、γ球蛋白和細胞色素c和其他蛋白質(zhì)的恢復率達到或超過(guò)99%。

配體固定于微濾過(guò)膜也能形成帶陽(yáng)離子功能基團的多聚體，膜的內側面（通常是流經(jīng)孔的壁）最初被一個(gè)親水多聚物如右旋糖苷、羥基纖維素或聚乙烯醇等覆蓋。然后，小配體如組胺酸、脫氧膽酸、多黏菌素B或DEAE等，或者是多陽(yáng)離子配體如PLL或PEI在親水的多聚物網(wǎng)中失去活動(dòng)性。整個(gè)網(wǎng)絡(luò )就如陽(yáng)離子多聚體一樣工作，配體相對分子質(zhì)量的高低并不十分重要。雖然這些膜吸附劑具有陽(yáng)離子特性，能夠吸附帶陰離子網(wǎng)的蛋白質(zhì)，但是在蛋白質(zhì)結合能力耗盡之后并未發(fā)現與配體PEI、PLL，甚至DEAE所結合的內毒素被取代下來(lái)。相應的吸附等溫線(xiàn)顯示出內毒素和蛋白質(zhì)獨-特的結合位點(diǎn)。在理想的環(huán)境條件下，由于配體對蛋白質(zhì)的結合力弱，蛋白質(zhì)的回收率幾乎接近100%。采用配體的內毒素去除法較少依賴(lài)溶液的pH值和離子力，例如，血清白蛋白溶液在中性條件下能不受蛋白質(zhì)在此pH值時(shí)變?yōu)閹ж撾姾傻挠绊懚杂休^好的純化效果。