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免疫機制的多樣性與TLR4在LPS識別中的關(guān)鍵作用

發(fā)布時(shí)間: 2024-07-01  點(diǎn)擊次數: 83次

在哺乳動(dòng)物體內發(fā)現至少存在10種TLRs分子,為何機體內存在多種TLRs?現已研究證實(shí),這是由于宿主識別不同微生物的需要而形成的免疫機制,如在果蠅,Toll家族不同成員參與對不同病原菌的防御作用:Toll 主要介導抗真菌反應,18-Wheeler拮抗細菌感染。哺乳動(dòng)物TLRs家族不同成員對微生物及其PAMPs的識別作用也存在相對的特異性。表7-3顯示TLR家族成員不僅識別脂質(zhì)和多糖(如LPS、肽聚糖),而且也與細菌或病毒DNA、RNA和蛋白質(zhì)作用。



TLR4是研究最早、作用也最為明確的TLR分子。除細菌LPS外,近年來(lái)也發(fā)現了其他一些配體,如抗腫瘤藥物泰素﹑熱休克蛋白60(hsp60)等。識別的病原菌主要有革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。有人認為,TLR4還能識別病毒融合蛋白(respiratory scyncytial virus,RSV),但該研究采用的動(dòng)物是C57BL/10ScCr小鼠,這種小鼠體內同時(shí)缺失Tlr4和IL-12受體β2鏈基因。由于1L-12是天然免疫和適應性免疫拮抗病毒感染的關(guān)鍵細胞因子,以及C57BL/10ScCr小鼠對IL-12,無(wú)反應。因此,TLR4對RSV的識別作用尚待探討。

TLR4雖能識別多種配體,但主要配體是細菌LPS,同CD14分子一樣,作為一種重要的LPS興奮性受體,在介導革蘭陰性細菌及其LPS的宿主反應中發(fā)揮重要作用。研究結果顯示,將TLR4基因轉入不表達TLR4的細胞內,可使不具有LPS反應的細胞具有一定的LPS反應性。相反,將LPS反應細胞內的TLR4基因進(jìn)行突變或缺失,細胞則出現LPS低反應性或耐受??筎LR4抗體能抑制不同血清型腸道桿菌LPS刺激人THP-1細胞釋放TNFα的作用,但對肽聚糖、熱滅活金黃色葡萄球菌等無(wú)抑制作用。

此外,TLR4胞外區和胞內區的點(diǎn)突變也顯示與人呼吸道LPS低反應性有一定的內在聯(lián)系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外區缺陷人群中,骨髓干細胞移植后革蘭陰性膿毒癥的發(fā)生率為16.7%,而正常TLR4的受者中,其感染的發(fā)生率為6.6%,提示TLR4 胞外區的突變可增加內毒素血癥的危險性。

然而,最能說(shuō)明TLR4作為L(cháng)PS重要受體的是近年來(lái)關(guān)于Lps基因的研究。1978年,James Watson首-次提出小鼠體內可能存在控制LPS反應的特定基因,取名為L(cháng)ps,認為該基因可能有兩個(gè)等位基因:即Lpsd(defective response>和Lpsn (normal response)。三種天然LPS低反應小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因為L(cháng)psd,表現為對LPS刺激的耐受性。James Watson等通過(guò)基因作圖將Lps基因座定位于小鼠4號染色體上。20世紀90年代以來(lái),隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,先后有多個(gè)研究小組采用定位克隆策略,對Lps基因座重新進(jìn)行精細作圖,繪制出圍繞Lps基因座染色體區的高分辨連鎖圖,最終將Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb長(cháng)的片段內。

為了進(jìn)一步明確Lps基因座內的候選基因及其編碼蛋白,1998年P(guān)oltorak等對該重要區域進(jìn)行高密度測序(近4萬(wàn)次),以及利用外顯子捕獲﹑選擇性原位雜交和定位克隆等技術(shù),在其區域內鑒別出多個(gè)基因,如TLR4基因、鋅脂蛋白基因、Tera同構體基因、大部分Pappa基因序列(編碼一種分泌型金屬蛋白酶)、芳香乙酰胺脫乙?;富蚝蚢strotactin同構體基因,Tlr4是唯-一與LPS作用有關(guān)的基因,Tlr4全長(cháng)基因都位于Lps基因座內。其他學(xué)者也獲得同樣結果。

進(jìn)一步研究顯示,C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位,即第3個(gè)外顯子上出現一個(gè)堿基顛換:C→A。在LPS反應品系小鼠基因組DNA中未發(fā)現相應的堿基突變。此外,C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬細胞均能檢測出Tlr4 mRNA,但不能檢測出C57BL/10ScCr小鼠巨噬細胞的Tlr4 mRNA。上述結果說(shuō)明,C3H/HeJ小鼠Tlr4為點(diǎn)突變,其突變并不影響Tlr4的轉錄,C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因則為完-全缺失,即為無(wú)效等位基因(null allele),有74723個(gè)核苷酸缺失,這包括了該基因的所有三個(gè)外顯子,因而出現隱性突變。由于Tlr4位于Lps內,兩種 LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均發(fā)生錯義突變(missense mutation)或缺失,進(jìn)一步證實(shí)Tlr4基因就是Lps的最佳候選基因。

進(jìn)一步研究顯示,T1r4基因的突變具有重要的功能意義。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3個(gè)外顯子上的點(diǎn)突變雖不影響該基因的轉錄,但因其密碼子的變化,使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸(proline)變?yōu)榻M胺酸(histidine)。該區域正為蛋白質(zhì)的胞漿區,該胞漿區為進(jìn)化中最保守的結構域,其結構域的完整性對于通過(guò)TLRs介導的LPS信號至關(guān)重要。這種氨基酸殘基的替換改變了TLR4信號轉導區域的拓撲結構,進(jìn)而破壞了與下游分子蛋白一蛋白間的相互作用,從而表現出對LPS信號轉導的共顯性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完-全缺失,不能表達TLR4蛋白,因而出現對LPS反應的隱性消失(recessive abolition)。由此可見(jiàn),C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突變表型分別與Tr4點(diǎn)突變或基因缺失非常吻合。

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