免疫機制的多樣性與TLR4在LPS識別中的關(guān)鍵作用

在哺乳動(dòng)物體內發(fā)現至少存在10種TLRs分子，為何機體內存在多種TLRs？現已研究證實(shí)，這是由于宿主識別不同微生物的需要而形成的免疫機制，如在果蠅，Toll家族不同成員參與對不同病原菌的防御作用：Toll 主要介導抗真菌反應，18-Wheeler拮抗細菌感染。哺乳動(dòng)物TLRs家族不同成員對微生物及其PAMPs的識別作用也存在相對的特異性。表7-3顯示TLR家族成員不僅識別脂質(zhì)和多糖（如LPS、肽聚糖），而且也與細菌或病毒DNA、RNA和蛋白質(zhì)作用。

TLR4是研究最早、作用也最為明確的TLR分子。除細菌LPS外，近年來(lái)也發(fā)現了其他一些配體，如抗腫瘤藥物泰素﹑熱休克蛋白60（hsp60）等。識別的病原菌主要有革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。有人認為，TLR4還能識別病毒融合蛋白（respiratory scyncytial virus，RSV），但該研究采用的動(dòng)物是C57BL/10ScCr小鼠，這種小鼠體內同時(shí)缺失Tlr4和IL-12受體β2鏈基因。由于1L-12是天然免疫和適應性免疫拮抗病毒感染的關(guān)鍵細胞因子，以及C57BL/10ScCr小鼠對IL-12，無(wú)反應。因此，TLR4對RSV的識別作用尚待探討。

TLR4雖能識別多種配體，但主要配體是細菌LPS，同CD14分子一樣，作為一種重要的LPS興奮性受體，在介導革蘭陰性細菌及其LPS的宿主反應中發(fā)揮重要作用。研究結果顯示，將TLR4基因轉入不表達TLR4的細胞內，可使不具有LPS反應的細胞具有一定的LPS反應性。相反，將LPS反應細胞內的TLR4基因進(jìn)行突變或缺失，細胞則出現LPS低反應性或耐受?？筎LR4抗體能抑制不同血清型腸道桿菌LPS刺激人THP-1細胞釋放TNFα的作用，但對肽聚糖、熱滅活金黃色葡萄球菌等無(wú)抑制作用。

此外，TLR4胞外區和胞內區的點(diǎn)突變也顯示與人呼吸道LPS低反應性有一定的內在聯(lián)系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外區缺陷人群中，骨髓干細胞移植后革蘭陰性膿毒癥的發(fā)生率為16.7%，而正常TLR4的受者中，其感染的發(fā)生率為6.6%，提示TLR4 胞外區的突變可增加內毒素血癥的危險性。

然而，最能說(shuō)明TLR4作為L(cháng)PS重要受體的是近年來(lái)關(guān)于Lps基因的研究。1978年，James Watson首-次提出小鼠體內可能存在控制LPS反應的特定基因，取名為L(cháng)ps，認為該基因可能有兩個(gè)等位基因：即Lpsd（defective response>和Lpsn （normal response）。三種天然LPS低反應小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因為L(cháng)psd，表現為對LPS刺激的耐受性。James Watson等通過(guò)基因作圖將Lps基因座定位于小鼠4號染色體上。20世紀90年代以來(lái)，隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，先后有多個(gè)研究小組采用定位克隆策略，對Lps基因座重新進(jìn)行精細作圖，繪制出圍繞Lps基因座染色體區的高分辨連鎖圖，最終將Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb長(cháng)的片段內。

為了進(jìn)一步明確Lps基因座內的候選基因及其編碼蛋白，1998年P(guān)oltorak等對該重要區域進(jìn)行高密度測序（近4萬(wàn)次），以及利用外顯子捕獲﹑選擇性原位雜交和定位克隆等技術(shù)，在其區域內鑒別出多個(gè)基因，如TLR4基因、鋅脂蛋白基因、Tera同構體基因、大部分Pappa基因序列（編碼一種分泌型金屬蛋白酶）、芳香乙酰胺脫乙?；富蚝蚢strotactin同構體基因，Tlr4是唯-一與LPS作用有關(guān)的基因，Tlr4全長(cháng)基因都位于Lps基因座內。其他學(xué)者也獲得同樣結果。

進(jìn)一步研究顯示，C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位，即第3個(gè)外顯子上出現一個(gè)堿基顛換：C→A。在LPS反應品系小鼠基因組DNA中未發(fā)現相應的堿基突變。此外，C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬細胞均能檢測出Tlr4 mRNA，但不能檢測出C57BL/10ScCr小鼠巨噬細胞的Tlr4 mRNA。上述結果說(shuō)明，C3H/HeJ小鼠Tlr4為點(diǎn)突變，其突變并不影響Tlr4的轉錄，C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因則為完-全缺失，即為無(wú)效等位基因（null allele），有74723個(gè)核苷酸缺失，這包括了該基因的所有三個(gè)外顯子，因而出現隱性突變。由于Tlr4位于Lps內，兩種 LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均發(fā)生錯義突變（missense mutation）或缺失，進(jìn)一步證實(shí)Tlr4基因就是Lps的最佳候選基因。

進(jìn)一步研究顯示，T1r4基因的突變具有重要的功能意義。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3個(gè)外顯子上的點(diǎn)突變雖不影響該基因的轉錄，但因其密碼子的變化，使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸（proline）變?yōu)榻M胺酸（histidine）。該區域正為蛋白質(zhì)的胞漿區，該胞漿區為進(jìn)化中最保守的結構域，其結構域的完整性對于通過(guò)TLRs介導的LPS信號至關(guān)重要。這種氨基酸殘基的替換改變了TLR4信號轉導區域的拓撲結構，進(jìn)而破壞了與下游分子蛋白一蛋白間的相互作用，從而表現出對LPS信號轉導的共顯性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完-全缺失，不能表達TLR4蛋白，因而出現對LPS反應的隱性消失（recessive abolition）。由此可見(jiàn)，C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突變表型分別與Tr4點(diǎn)突變或基因缺失非常吻合。