精準選擇 助推高效 | PSNG—基因重組鱟試劑領(lǐng)域的重磅出擊

在制藥過(guò)程中，細菌內毒素的檢測依賴(lài)于鱟血資源。隨著(zhù)注射劑、疫苗類(lèi)、化學(xué)藥品類(lèi)等制劑品的需求不斷增長(cháng)，鱟血資源的使用率越來(lái)越高；同時(shí)，鱟試劑中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子導致的假陽(yáng)性結果。所以，建立一套不依賴(lài)鱟生物進(jìn)行細菌內毒素檢測的快捷、高效的補充替代方法尤為重要。

作為新型的重組鱟試劑檢測方法：PSNG、rFC則備受關(guān)注。

一、PSNG和rFC的概念

01 PSNG

PSNG（基因重組鱟試劑）是一種基因工程技術(shù)合成的細菌內毒素定量檢測試劑，該試劑不依賴(lài)鱟血資源，滿(mǎn)足可持續發(fā)展的目標。

基因重組鱟試劑

它*模擬了天然鱟試劑LAL的酶聯(lián)反應，包含C因子、B因子、凝固酶原，一種擁有與傳統鱟試劑相同酶聯(lián)反應,同時(shí)又消除了與1,3-β-D-葡聚糖交叉反應造成假陽(yáng)性結果的內毒素檢測試劑。

PSNG（上圖右側）成功去除了天然鱟試劑（上圖左側）的G因子干擾。

02 rFC

重組C因子法（rFC）是通過(guò)體外重組鱟凝血級聯(lián)反應的第一個(gè)組分：C因子，激活的C因子直接剪切一個(gè)熒光底物，產(chǎn)生的信號被熒光酶標儀識別。相較于傳統的動(dòng)態(tài)LAL法，重組C因子法只有一種反應機制。

反應機制：左側為基因重組鱟試劑 右側為重組C因子試劑

二、LAL、PSNG、rFC對比情況

作為新型的重組鱟試劑PSNG、rFC，與傳統的鱟試劑LAL進(jìn)行細菌內毒素檢測時(shí)又會(huì )有什么不同呢？

01 PSNG與LAL在檢測內毒素上比較

（圖1）

由圖1所示，通過(guò)研究在顯色底物存在下，使用三種重組酶原的多種組合，確定三種重組酶原是否能重建反應步驟。

結果證實(shí)，當三種重組酶原同時(shí)存在時(shí)，內毒素才能激活蛋白酶活性，得出了PSNG與LAL在檢測內毒素上具有等效性。另外，研究證實(shí)了，三種重組酶原的蛋白酶活性大大增強，信號放大。

02 LAL、PSNG、rFC對內毒素敏感度比較

（圖2）

從反應機制上看，rFC缺少了級聯(lián)放大的兩個(gè)環(huán)節（加速反應），只能通過(guò)熒光檢測人為放大（減少了來(lái)源于自然反應的特異性）。

如圖2所示，凝血酶的活化是LAL信號放大的主要驅動(dòng)力；B因子的活化是針對內毒素的特異性活化，由此可以得出，PSNG（rCR）敏感度比rFC更高。

03 PSNG與LAL檢測時(shí)間比較

（圖3）

如圖3所示，通過(guò)對一系列濃度RSE（細菌內毒素參考標準品）應用PyroSmart NextGen™（PSNG）和典型動(dòng)態(tài)顯色試劑檢測得到的起始時(shí)間值，得出PyroSmart NextGen™較典型的動(dòng)態(tài)顯色試劑檢測縮短了大約一半的時(shí)間。

04 PSNG與LAL批間一致性比較

（圖4）

天然來(lái)源的LAL試劑具有固定的批次間變異性，而PyroSmart NextGen™試劑表現出批次間的一致性。圖4所示，六個(gè)單獨批次的PyroSmart NextGen™試劑的曲線(xiàn)標準趨于一致，證明PSNG具有重復性和可預測性的性能。

05 PSNG與LAL對內毒素特異性比較

（圖5）

圖5的X-Y軸分別表示的是加標/不加標1,3-β-D葡聚糖的各批次PyroSmart NextGen™和系列標準濃度的反應。結果顯示了添加1,3-β-D葡聚糖對應用PyroSmart NextGen™對內毒素的檢測不存在干擾，各批次間相關(guān)性良好。

06 PSNG驗證性能

（圖6）

（圖7）

如圖6、圖7所示，應用PyroSmart NextGen™在50-0.005 EU/mL內毒素范圍內，在兩批次、四個(gè)分析人員、三天內條件下，執行了24個(gè)性能驗證實(shí)驗。依據ICH Q2指南標準，結果顯示各驗證參數滿(mǎn)足標準要求。

07 PSNG、rFC、LAL針對檢測樣品的比較

（圖8）

（圖9）

（圖10）

圖8、圖9、圖10所示，適合性/一致性研究測試了多個(gè)成品、水、緩沖液等樣品，得出PyroSmart NextGen™較 LAL具有相等或較低的不干擾稀釋倍數(NID)。另外，Muroi 等人報告了使用PyroSmart NextGen™前身 PyroSmart 試劑檢測藥典118種腸外注射藥物得出了相似的結果。

基于以上數據得出結論，重組鱟試劑方法(rCR)適合于廣泛的產(chǎn)品檢測?？杀刃匝芯繙y試了多種來(lái)源的細菌內毒素和水樣，證實(shí)應用PyroSmart NextGen™檢測具有較好的相對回收率。

08 PSNG、LAL、rFC方法對比

（圖11）

如圖11 所示，PSNG優(yōu)于重組C因子法。PSNG檢測過(guò)程不需要更換方法和設備，就能繼續同樣的工作流程。

三、總結

從LAL、PSNG、rFC對比情況來(lái)看，PyroSmart NextGen™較rFC、LAL在細菌內毒素檢測上具有較強的優(yōu)勢：

相比重組C因子內毒素檢測方法，PyroSmart NextGen™內毒素檢測試劑可以產(chǎn)生級聯(lián)放大反應，使得內毒素檢測更加高效和靈敏。

文章參考來(lái)源：PYROSMART NEXTGEN RECOMBINANT LAL REAGENT