內毒素的發(fā)現與起源（二）：生物領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)

內毒素的發(fā)現主要應歸功于對霍亂弧菌（vibrio cholera）的研究。在19世紀后期，經(jīng)常發(fā)生霍亂流行，尤其是1892年前后，在世界一些大的海港城市發(fā)生了大規?；魜y流行，成千上萬(wàn)的人因此而死亡。因此，當時(shí)霍亂研究備受關(guān)注。1884年，Robert Koch證明霍亂弧菌為霍亂的致病菌，并在他的實(shí)驗室里系統地開(kāi)展了霍亂弧菌的致病性研究。當時(shí)在該實(shí)驗室工作的Richard Pfeiffer（1858~1945）研究發(fā)現，霍亂弧菌除釋放不耐熱的外毒素到培養基外，并觀(guān)察到霍亂弧菌能產(chǎn)生第2種完-全不同的毒素，這種毒素可牢固結合在細菌細胞上，具有很強的毒性作用，在細菌溶解時(shí)才被釋放出來(lái)。由于這種毒素與已發(fā)現的其他毒素明顯不同，Pfeiffer稱(chēng)其為內毒素（endotoxin）。之后“內毒素"一詞被文獻廣泛引用。

幾乎同時(shí)，意大利人Eugenio Centanni（1863~1948）利用乙醇及其他分離過(guò)程，從大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)菌等自溶物中分離出---種無(wú)菌白色粉末的高致熱原性物質(zhì)。該物質(zhì)對熱十分穩定，不屬于蛋白質(zhì)，且與細菌的生存和細菌感染引起的病理變化密切相關(guān)，被他稱(chēng)為Pyrotoxina。應該說(shuō)，Centanni已獲得較高純度的內毒素，是第一個(gè)認識細菌致熱原與內毒素間密切關(guān)系的人。

Edmundweil（1879~1922）和ArthurFelix（1887~1956）在變形桿菌的研究中發(fā)現，細菌培養物呈兩種生長(cháng)形式：即聚集（swarming）生長(cháng)和不聚集（nonswarming）生長(cháng)。他們將聚集生長(cháng)的細菌稱(chēng)為Hauch（德語(yǔ)），不聚集生長(cháng)的細菌稱(chēng)為Ohne hauch。并從中分離出兩種不同的物質(zhì)，被他們分別稱(chēng)為H-抗原和O抗原。其中，O-杭原耐熱。實(shí)際上，O抗原就是內毒素。此外，A Joos將從鼠傷寒菌分離得到的熱穩定物質(zhì)稱(chēng)為β-agglutinogens。

Pfeiffer的內毒素、Centanni的pyrotoxina和其他學(xué)者分離出的細菌過(guò)濾物均為含有多種細菌產(chǎn)物的混合物。經(jīng)歷了數十年后，法國微生物學(xué)家Andre Boivin（1895~一1949）與羅馬尼亞科學(xué)家Lydia Mesrobeanu（1908~1978）一道在1932年發(fā)明了一種至今仍被廣泛采用的從革蘭陰性細菌提取內毒素的方法：即三-氯-乙-酸（trichloroacetic acid，TCA）法。該方法分離得到的產(chǎn)物主要為多糖和脂質(zhì)，僅含少量蛋白，被他們稱(chēng)為antigenes glycido-lipidiques（法語(yǔ)）。Pennel和Huddeleson利用TCA法從布魯桿菌中也獲得了細菌毒素，被他們稱(chēng)為內抗原（endoantigen）。Walter T.J.Morgan和Walter F.Goebel利用有機溶劑和水進(jìn)一步改進(jìn)TCA提取方法，從而使獲得的產(chǎn)物更為均一。隨后的研究中，許多學(xué)者都采用Morgan的提取物。

20世紀40年代初期，美國Bradley Coley醫師利用滅活的Bacillus prodigiousus和鏈球菌的高致熱原性混合物治療惡性腫瘤病人，取得明顯療效。Murray Shear試圖從Coley疫苗的活性成分Bacillus prodigiousus中分離出致腫瘤壞死的物質(zhì)。結果顯示，分離物主要為多糖和脂質(zhì)成分，含有少量蛋白，被Shear等命名為脂多糖（lipopolysaccharide）。

20世紀40年代后期，otto Westphal和Otto Luderitz系統地分析了Walter Morgan從沙門(mén)菌、大腸桿菌和其他腸道桿菌的分離物，進(jìn)一步發(fā)現分離物的致熱活性主要集中在O-抗原復合物中，且未降解多糖呈高致熱原性，結合蛋白的多糖活性較低，降解多糖和單純蛋白質(zhì)則完-全無(wú)活性。1952年，Westphal建立了一種新的更有效的分離方法，即熱-酚-水抽提法（hot-phenol-water extraction method），其分離物幾乎不含蛋白，僅含糖、磷和脂肪酸成分，具有非常強的生物活性，靜脈內注射1ng/kg，就可致人發(fā)熱，被Westphal和Luderitz稱(chēng)為脂多糖。該方法的建立被認為是內毒素研究史-上的里程碑，并成為經(jīng)典的分離方法而被廣泛應用。

顯然，早在20世紀初期，人們已從不同的革蘭陰性細菌中分離出不同形式或不同純度的內毒素物質(zhì)，不同的實(shí)驗室對其有不同的命名。隨著(zhù)內毒素分離方法不斷改進(jìn)和提高，以及相關(guān)學(xué)科，如化學(xué)、生物學(xué)、血清學(xué)的發(fā)展，20世紀50年代后，人們逐步認識到這些從革蘭陰性細菌分離得到的物質(zhì)實(shí)際上為同一種成分，并且是所有革蘭陰性細菌細胞壁外膜上的主要結構成分，對細菌生長(cháng)和活力至關(guān)重要，是革蘭陰性細菌的主要致病因子，并將這些物質(zhì)統稱(chēng)為內毒素或脂多糖（LPS）。從此，內毒素的研究日益受到微生物學(xué)家，臨床醫師、生物學(xué)家和免疫學(xué)家的普遍重視。

1952年和1958年分別在美國紐約和德國弗賴(lài)堡召開(kāi)了第一、二屆內毒素國際會(huì )議。1988年，在美國得克薩斯大學(xué)微生物學(xué)教授L.Joe Berry的倡導和努力下，成立了國際內毒素學(xué)會(huì )（International Endotoxin Society，IES），第一屆學(xué)會(huì )主席為賓夕法尼亞大學(xué)免疫學(xué)教授Alois Nowotny。目前會(huì )員已遍布六大洲，39個(gè)國家，400多名會(huì )員。1994年，創(chuàng )辦了《內毒素研究雜志》（Journal of Endotoxin Research），得克薩斯大學(xué)醫學(xué)中心的David C.Morrison教授為第一任主編。