選擇性清除內毒素的最佳吸附條件

圖35-3顯示了從蛋白質(zhì)溶液中吸附內毒素的原理。陰離子交換配體和一切內毒素選擇性配體在工作條件下帶正電荷網(wǎng)，如此，帶負電荷的蛋白質(zhì)和內毒素在低離子力時(shí)被吸附，此時(shí)蛋白質(zhì)和內毒素幾乎不能回復。當吸附能力耗盡之后（不取決于是否系內毒素特異性），蛋白質(zhì)的回復便可接近100%。所采用配體的結合位點(diǎn)的多少對蛋白質(zhì)和內毒素來(lái)講是一樣多的，所以蛋白質(zhì)和內毒素對這些結合位點(diǎn)的競爭影響了內毒素的清除。同樣，對于一些已經(jīng)被吸附的內毒素來(lái)說(shuō)，在蛋白質(zhì)濃度比內毒素濃度高出6個(gè)數量級的情況下也是可以被取代下來(lái)的。

另一方面，內毒素和帶陽(yáng)離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)形成復合物以致親和配體和蛋白質(zhì)競爭內毒素，如果在吸附劑表面的電荷密度高或者使用一種選擇配體，使得平衡傾向于吸附劑，則可使內毒素得到去除。當帶陽(yáng)離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)從陰離子交換劑上解脫時(shí)，能得到幾乎100%的蛋白質(zhì)。

迄今為止，以上所提及的吸附劑沒(méi)有一個(gè)已被實(shí)際用于蛋白質(zhì)溶液的內毒素清除。但是，離子力起到了重要的作用，特別是在吸附過(guò)程的最初階段。低離子力的物質(zhì)，相當于小于50mmol/L的NaCl，常被推薦用作離子交換劑。具有較高離子力的物質(zhì)如多黏菌素B和DAH，在被用作親和吸附劑時(shí)，與配體的結合主要依靠離子間作用力和疏水作用。在合適的條件下，其關(guān)系常數超過(guò)109。多陽(yáng)離子配體較少依靠離子力。蛋白質(zhì)的去污染與其在環(huán)境條件下的等電點(diǎn)及pH值穩定性有很大的關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，當pH值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，內毒素能最大限度地被去除。強堿或強酸性蛋白質(zhì)的化學(xué)特性使其在純化時(shí)發(fā)生不可逆的丟失，而且沉淀反應也是一個(gè)問(wèn)題，所以必須尋找一個(gè)折中的辦法。對于酸性蛋白質(zhì)而言，環(huán)境pH值應該盡可能接近PI，同時(shí)應該采用多聚的或疏水性弱的配體。等電點(diǎn)接近7的蛋白質(zhì)應該在pH≈PI的環(huán)境下進(jìn)行去污染。雖然用內毒素選擇性配體能得到更好的結果，但陰離子交換劑也可以采用。離子交換劑對堿性蛋白質(zhì)的去污染結果也相當不錯，特別是帶有4條氨基酸基團的配體，它在堿性條件下能顯示出較高的離子密度，并在提高pH值后與內毒素的吸附相當匹配。

應該注意到，不僅僅是帶凈電荷的蛋白質(zhì)，也包括所有陽(yáng)離子配體，其電荷密度隨著(zhù)pH值的改變會(huì )發(fā)生變化，但除外那些有4條氨基酸的配體。pH值的升高可導致電荷密度的減少，具體數值可因配體的pK或pI而有差別。

如果內毒素和帶負電荷的蛋白質(zhì)之間的作用是由Ca2+介導的，則應該輔以1～5mol/L的EDTA。EDTA是一種強螯合劑，可使蛋白質(zhì)-Ca2+-內毒素復合物的平衡傾向于解離，由此增進(jìn)吸附劑的去污效果.此外，如果要采用輔以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不帶電荷的去污劑，則應事先篩選，因為在應用這些物質(zhì)時(shí)會(huì )帶來(lái)其他問(wèn)題。

評價(jià)層析柱在耗盡其蛋白質(zhì)結合能力之后留在柱里面的內毒素的量是十分必要的，這在部分吸附時(shí)也是一樣的道理，即蛋白質(zhì)或內毒素濃度的變化會(huì )同時(shí)影響到清除效率和蛋白質(zhì)的回收。