一、鱟試劑的標化問(wèn)題
鱟試劑為鱟變形細胞的細胞溶解物,制備時(shí)可采用裂解法和機械方法使細胞破裂。鱟試劑的敏感性可受到動(dòng)物個(gè)體差異、季節差異及生產(chǎn)工藝過(guò)程中不穩定因素的影響。因此各批次間,其敏感性差異很大。即使是同一批試劑,由于操作、保存方法、環(huán)境因素等影響,其敏感性亦不一樣。鱟試劑在液態(tài)時(shí)極不穩定,往往很難保存。貯存于4 ℃冰箱,其活性一般于4~5月開(kāi)始下降,8個(gè)月左右*失活。冷凍保存的穩定性稍高于液態(tài)保存。`真空凍干粉劑保存為目前最-好的方法,- 30℃保存其有效期可達2年。
改善生產(chǎn)工藝,控制制劑中的參數,可使試劑的敏感性和穩定性增高。國內丁友玲等報道,鱟試劑含水量控制在5%以下,總蛋白量控制在5mg/ml以上,Ca++、Mg++控制在0.01~0.1M,可使鱟試驗的穩定性提高,重演性增強。
試驗前,應以WHO標準內毒素作標定,如試劑敏感性為1ng/ml或小于1ng /ml,則認為是敏感的,可以應用。美國制備了參考鱟試劑,各種鱟試劑在應用前與其比較,可獲得相對效力。
除應解決好鱟試劑的標化問(wèn)題外,對鱟試劑的操作程序亦應標化,因為操作上微小的差異即可使試劑的敏感性改變。
二、內毒素的標化問(wèn)題
從各種細菌制備的內毒素,或以同一種細菌制備的內毒素,或內毒素批次間、批次內,其活性均可不一致。所以應用LT法(鱟試驗法,Limulus test)檢測內毒素時(shí),需要一個(gè)標準的內毒素作為對照參比。
大腸桿菌內毒素在各種細菌內毒素的LT反應上處于中值的位置(圖4),且其穩定、可溶,因此將大腸桿菌內毒素作為參考標準內毒素(Reference Standar d En-dotoxin,RSE)是較為適宜的。
根據以上理由及原則,美國FDA下屬的生物制品管理局(BOB)組織了大規模的研究。制備了一系列標準參考內毒素(表4)。分別命名為16、EC、EC-1,EC-2………,EC-5。其中EC-2是以大腸桿菌O111B4。(Braude株)提取的,各項指標均為滿(mǎn)意。
日本從大腸桿菌UKTB中提取了內毒素,作為日本的標準參考內毒素,采用酚水抽提法,然后再用乙醇沉淀?;瘜W(xué)分析、熱原性及鱟試劑激活性*符合RSE的標準。且其在干燥狀態(tài)下穩定性極-好,可長(cháng)期應用,但如溶于水,則穩定性可下降。
最近美國藥品部門(mén)已向WHO提供了一批新的RSE,供國際上檢測時(shí)作為參比用,這使LT試驗結果容易統一。實(shí)際上WHO對此早就組織了合作研究,包括多種鱟試劑及內毒素。
從理論上講,一種RSE需滿(mǎn)足下述條件:①干燥制劑;②在性質(zhì)是可用的;③在室溫下穩定;④吸濕性少;⑤易溶于水;⑥在水及生理鹽水中清澈;⑦可致家兔及人反應;⑧須從常見(jiàn)的菌株提取。
但目前所有RSE均不*符合上述條件,因此,有關(guān)內毒素的標化問(wèn)題仍須進(jìn)行深入的研究。
具體檢測時(shí),各實(shí)驗室可采用對照標準內毒素(Control Standard Endotoxin,CSE),但其效能必須先以RSE進(jìn)行標定。CSE效能的計算公式為:
CSE效能=GM比值×E Eu/μg
其中GM比值為算術(shù)平均值,E為RSE的效能,常為6000Eu/管,CSE與 RSE作平行的LT試驗,試管數N應大于16,然后算出CSE與RSE相應的比值R1,R2,……RN,將這些比值換算成以10為底的對數值,然后計算平均和標準的SD,平均SD的反對數即為GM比值。
1981年9月美國、日本、英國、西德、瑞典、意大利六國學(xué)者及監定部門(mén)的代表在美國Woods Hole 海洋學(xué)院召開(kāi)了用于注射用品的鱟試劑和內毒素標準的國際會(huì )議,會(huì )上Difco實(shí)驗室的Fleishman報告了“自多種革蘭氏陰性菌內毒素的LT法檢測熱原的比較”一文,提出了被檢內毒素相對活力的概念,即與參考標準內毒素(EC-2)比較后的相對活力,計算公式如下圖:
其中5 Eu/ng是FDA標準內毒素EC-2的指-定活力。